細胞培養(yǎng)技術(shù)廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)研究、再生醫(yī)學(xué)和生物技術(shù)生產(chǎn)，但生物和化學(xué)因素都可能導(dǎo)致細胞培養(yǎng)物污染。在大多數(shù)情況下，細胞生長緩慢、形態(tài)改變、培養(yǎng)基pH 值快速變化以及培養(yǎng)物中死亡或漂浮細胞數(shù)量增加都是污染的后果。因此，應(yīng)定期篩查細胞培養(yǎng)中的相應(yīng)污染物，以防止結(jié)果不一致和其它嚴重后果。同時，需要特殊的防護措施，如生物安全柜、封閉容器和其它專門的防護設(shè)備，以最大限度地降低接觸危險物質(zhì)的風(fēng)險并保證無菌操作條件。本文將簡要介紹細胞培養(yǎng)中常見的污染來源，以及相應(yīng)的預(yù)防和緩解措施。
支原體污染
支原體是屬于細菌綱柔膜菌的最小的自我復(fù)制生物。它們由脂蛋白質(zhì)膜、核糖體和基因組組成，基因組由580 至 2200 kb 大小的環(huán)狀雙鏈 DNA 分子組成。支原體的生物合成能力有限，需要進入適當(dāng)?shù)乃拗黧w內(nèi)繁殖并存活很長時間。它們的尺寸非常?。▇0.1–0.2 μm），無法在標(biāo)準(zhǔn)明視野顯微鏡下識別，這也是為什么它們經(jīng)常在許多實驗室中無法被發(fā)現(xiàn)的原因。它們沒有細胞壁，對細胞培養(yǎng)中使用的許多常見抗生素（如青霉素或鏈霉素）具有抗藥性。最重要的是，支原體污染不會產(chǎn)生其它細菌或真菌污染特有的渾濁度。
支原體傳播到細胞培養(yǎng)中的典型方式包括從研究實驗室或商業(yè)供應(yīng)商獲得的受感染培養(yǎng)物、培養(yǎng)基、血清或試劑中引入支原體交叉污染。此外，使用非無菌用品、攜帶支原體的實驗室人員感染、培養(yǎng)箱或通風(fēng)柜中支原體的擴散、液氮罐中細胞培養(yǎng)物的污染、通過空氣中的顆粒物和氣溶膠傳播、過度使用抗生素以及培養(yǎng)容器密封不當(dāng)也是導(dǎo)致支原體污染的原因。
盡管支原體與宿主細胞競爭生物合成前體和營養(yǎng)物質(zhì)，但在受影響的細胞培養(yǎng)物中觀察到的生長率變化通常很小，這就是不易檢測到相應(yīng)污染的原因。盡管如此，支原體可以廣泛影響宿主的DNA、RNA 和蛋白質(zhì)代謝，影響細胞內(nèi)氨基酸和可用 ATP 水平，改變細胞表面抗原，并可引起 DNA 碎片化和顯著的染色體改變。因此，定期檢測和快速識別此類污染物至關(guān)重要。為了實現(xiàn)這一點，開發(fā)了許多靈敏且特異的檢測，可以檢測相應(yīng)的感染。檢測支原體污染的黃金標(biāo)準(zhǔn)是，首先將條件培養(yǎng)上清液樣品添加到用于支原體培養(yǎng)的液體培養(yǎng)基中，并在肉湯、瓊脂或指示細胞中孵育幾天。但這種方法很耗時，因此引入了更快的檢測方法。這些方法包括使用熒光染料（如DAPI）進行特異性 DNA 染色、ELISA 檢測、用支原體特異性核糖體探針進行 RNA 標(biāo)記、酶促程序、流式細胞術(shù)、比色或基于試紙的支原體檢測試驗、以及復(fù)雜的傅里葉變換紅外 (FITR) 顯微光譜法。熒光染料染色相當(dāng)不具特異性，而大多數(shù)檢測方法具有較高的分析靈敏度（即檢測識別污染物的能力）和特異性（即測量支原體而不是密切相關(guān)的非支原體物種的能力）。
支原體在受感染的培養(yǎng)物中可以產(chǎn)生多種影響。因此，開發(fā)了多種用于清除相應(yīng)污染物的試劑和方法。目前有多種物理、化學(xué)、免疫和化學(xué)治療方法可用于清除支原體污染物。然而，許多這些方法并不實用，因為它們要么非常耗時，需要特殊設(shè)備，只能捕獲有限數(shù)量的支原體物種，要么總體效率低下。起初，引入了幾種抑制支原體生長的抗生素，但大多數(shù)抗生素效果不佳，且對真核細胞有害，或者由于對相應(yīng)藥劑產(chǎn)生了耐藥性而療效有限。盡管如此，現(xiàn)在有幾種更具選擇性和有效性的抗支原體試劑，在大多數(shù)情況下，只需一輪出輪即可清除支原體感染。在大多數(shù)情況下，這些清除劑含有大環(huán)內(nèi)酯類、四環(huán)素類、喹諾酮類或它們的組合。它們通過破壞細菌拓撲異構(gòu)酶 II 來阻斷細菌核酸合成，抑制拓撲異構(gòu)酶 IV 和 DNA 旋轉(zhuǎn)酶的催化活性，以及破壞細菌染色體，從而發(fā)揮抑制活性。盡管如此，用這些產(chǎn)品處理或預(yù)防支原體感染可能會引起嚴重的細胞毒性和遺傳毒性作用。因此，使用用于清除支原體感染的化合物時應(yīng)謹慎使用并經(jīng)過深思熟慮，因為它們有可能改變培養(yǎng)的結(jié)果。
病毒污染
與支原體感染相比，細胞培養(yǎng)中的病毒污染物威脅更為嚴重，因為病毒污染物檢測難度大，而且缺乏處理感染的細胞培養(yǎng)物的方法。此外，一些病毒能夠?qū)⑵浠蚪M整合到宿主細胞中，在某些情況下會導(dǎo)致新病毒顆粒的永久產(chǎn)生。這對操作人員來說是一種潛在的健康風(fēng)險，可能是病毒水平傳播到其它細胞系的來源。因此，這對受感染細胞系的生物安全分類有直接影響。不幸的是，用于系統(tǒng)評估病毒污染物的通用檢測相當(dāng)復(fù)雜且沒有方向。如果無法準(zhǔn)確了解病毒的真實性，那檢測方法將僅限于電子顯微鏡和逆轉(zhuǎn)錄病毒逆轉(zhuǎn)錄酶測定。當(dāng)懷疑存在傳染性病毒時，電子顯微鏡的多功能性是一種有效、通用且無偏見的手段。該技術(shù)適用于獲取高分辨率圖像，從而立即整體性觀察實際的細胞感染狀態(tài)和病毒的形狀。通過觀察到的形態(tài)和大小，可以立即對病毒類型進行初步分類。例如，成熟的逆轉(zhuǎn)錄病毒通常是球形的有囊膜顆粒，平均直徑在100 到 200 nm之間，6種逆轉(zhuǎn)錄病毒屬之間的形態(tài)各異。透射電子顯微鏡 (TEM) 特別適合于直接觀察生物樣本中的病毒，而無需事先假設(shè)傳染源。
化學(xué)污染
任何在細胞培養(yǎng)中引起不良影響的非生命化合物都需要特別注意。當(dāng)濃度足夠高時，即使是必需的營養(yǎng)素也會產(chǎn)生毒性作用。培養(yǎng)基、血清和水可以將雜質(zhì)帶入細胞培養(yǎng)中。然而，塑料管、細胞培養(yǎng)容器和儲存瓶中的增塑劑，以及熒光或紫外線在培養(yǎng)基中形成的自由基或玻璃器皿和移液器上的沉積物，都可能導(dǎo)致污染。最關(guān)鍵的是內(nèi)毒素，它來自大多數(shù)革蘭氏陰性菌的外細胞膜。它們由相當(dāng)穩(wěn)定的脂多糖(LPS) 組成，這些脂多糖從細菌中脫落，在細菌裂解過程中會大量釋放。因此，從玻璃器皿去除熱原需要在高溫下進行加熱，而這些物質(zhì)對高壓滅菌具有相當(dāng)?shù)哪褪苄浴Ｒ虼?，大多?shù)市售的即用型細胞培養(yǎng)基和添加物都是以不含內(nèi)毒素或低內(nèi)毒素水平制備的。此外，可靠的細胞培養(yǎng)基和添加物生產(chǎn)商會提供分析證書，表明相應(yīng)溶液或化合物中的內(nèi)毒素水平。
某些培養(yǎng)條件（如低血清濃度、高光照）會刺激高反應(yīng)性自由基的形成，從而可能導(dǎo)致DNA 損傷、蛋白質(zhì)交聯(lián)、脂質(zhì)氫過氧化物和誘導(dǎo)細胞凋亡。因此，通常在細胞培養(yǎng)基中添加抗氧化劑，如抗壞血酸、N-乙酰-L-半胱氨酸或具有自由基清除活性的維生素，如維生素 E、維生素 A、維生素 C，以防止氧化應(yīng)激及其后果。或者，可以在培養(yǎng)基中添加微量元素硒，作為抗氧化酶的輔助因子，如谷胱甘肽過氧化物酶，以消滅反應(yīng)性過氧化物。
此外，高濃度的重金屬，如鉛、鎘和汞，對許多細胞類型都有毒性。因此，在使用前對用于制備培養(yǎng)基或添加物的水和溶劑進行重金屬檢測非常重要?；蛘撸绻麑嶒炇矣盟贿m合細胞培養(yǎng)，則應(yīng)使用提供分析證書的商業(yè)供應(yīng)商提供的純化水。
種間/種內(nèi)交叉污染
細胞系被來自同一物種的無關(guān)細胞（種內(nèi)污染）或來自不同物種的細胞（種間污染）污染是一個常見且反復(fù)出現(xiàn)的問題。具體來說，當(dāng)污染物是快速分裂的細胞系時，它會過度生長并取代原始培養(yǎng)物。如果污染未被發(fā)現(xiàn)，可能會導(dǎo)致不可靠和不可重復(fù)的結(jié)果。交叉污染的來源多種多樣，包括通過氣溶膠或移液器進行的傳播、不同細胞系之間共享培養(yǎng)基和試劑以及培養(yǎng)基使用不當(dāng)。
有多種方法可用于確定細胞系交叉污染。物種間交叉污染可通過同工酶分析檢測，該分析利用電泳結(jié)合模式來檢查不同物種間一組細胞內(nèi)酶的單個同工酶的結(jié)構(gòu)和移動性的細微差異。人類細胞的物種內(nèi)交叉污染可通過對人類淋巴細胞抗原(HLA) 基因座進行分型來識別。此外，分子血清學(xué)方法、使用合成探針或引物的基因檢測以及基于序列的直接 DNA 測序分型可以區(qū)分不同的 HLA 基因型。
清潔和滅菌
生物安全取決于實驗室的清潔度。一般準(zhǔn)則是嚴格遵守所有可能的安全規(guī)則。忽視或不遵守任何安全規(guī)定都可能導(dǎo)致相關(guān)感染和環(huán)境污染。因此，需要通過對操作期間使用的生物制劑進行凈化來降低生物風(fēng)險。
在適當(dāng)?shù)膹U物管理中，應(yīng)盡可能對滅活方法進行適當(dāng)?shù)尿炞C。原則上，凈化方法主要有四類，即(i) 熱滅菌、(ii) 液體消毒、(iii) 蒸汽和氣體消毒，以及 (iv) 紫外線照射。高壓滅菌是物料滅菌和生物制劑凈化或滅活最有效、最可靠的方法。這是一種使用高壓水蒸汽的滅菌方法，是培養(yǎng)基、玻璃器皿和移液器吸頭凈化的首選方法。然而，必須保持足夠高的溫度和高壓一段時間，以保證孢子滅活。通常，在 121°C 下高壓滅菌 60-90 分鐘足以使廢物溫度至少達到 115°C 并持續(xù) 20 分鐘。此外，高壓滅菌器的操作和維護只能由經(jīng)過培訓(xùn)的人員進行，并且應(yīng)通過生物指示劑定期檢查高壓滅菌是否成功。必須將廢物或高壓滅菌物料放置在具有良好熱滲透性的容器或密封高壓滅菌袋中。危險化學(xué)物質(zhì)或放射性廢物不應(yīng)進行高壓滅菌。
化學(xué)消毒通常是表面去污的首選方法。為了使消毒劑發(fā)揮最佳效果，必須考慮幾個因素。首先，消毒劑應(yīng)具有針對要去除的生物制劑的特異性。其次，消毒劑應(yīng)適合應(yīng)用領(lǐng)域，因為當(dāng)應(yīng)用于表面或液體時，活性可能會有顯著差異。最后，消毒劑的一般應(yīng)用條件（例如，所需接觸時間、工作濃度）以及在存在影響因素（例如，酸、有機負荷）的情況下的有效性可能會有所不同。
在封閉系統(tǒng)中使用類似的蒸氣和氣體可以提供極好的消毒效果。一些環(huán)境使用過氧化氫、二氧化氯、戊二醛、多聚甲醛、環(huán)氧乙烷和過乙酸的氣溶膠來凈化生物安全柜或培養(yǎng)箱。然而，所有這些化學(xué)物質(zhì)都是危險的，使用這些物質(zhì)消毒只能由有經(jīng)驗和受過培訓(xùn)的人員進行。
最后，暴露于紫外線(UV) 輻照可以有效殺死大多數(shù)微生物。尤其是被大氣吸收的 UV-C 光（光譜范圍：100–280 nm），對各種微生物的破壞力最大。因此，這種紫外線區(qū)域通常用于生物安全柜中以減少表面污染。然而，暴露于紫外線可能會導(dǎo)致操作人員的眼睛和皮膚灼傷，因此應(yīng)謹慎使用。
細胞操作中的生物安全問題
細胞培養(yǎng)可能會對人類健康和環(huán)境造成危害，因此需要將其劃分為一個考慮多種因素的生物安全水平。在使用某個細胞系之前，必須準(zhǔn)確了解這些風(fēng)險，同時考慮到其固有屬性、基因操作類型以及相應(yīng)細胞系固有的生物危害，而這些危害可能會因污染病原體而顯著增加。盡管這些估算必須根據(jù)具體情況進行，但也有一些一般準(zhǔn)則需要遵循。首先，所研究細胞的遺傳關(guān)系與人類越接近，對人類的風(fēng)險就越高，因為污染病原體通常具有特定的物種屏障。盡管如此，仍應(yīng)小心謹慎，因為某些污染生物有可能跨越通常的物種屏障。其次，細胞系的致瘤潛力在很大程度上取決于其來源。例如，上皮細胞和成纖維細胞具有較低的腫瘤誘導(dǎo)潛力，而造血細胞的腫瘤誘導(dǎo)潛力則明顯較高。第三，已在許多實驗室中使用多年的、充分表征的細胞系的總體風(fēng)險低于未經(jīng)表征的連續(xù)生長細胞系或原代細胞。在識別和評估潛在風(fēng)險后，必須確定避免或降低這些風(fēng)險的方法，包括隔離、限制人員和設(shè)備進出細胞培養(yǎng)實驗室、按照標(biāo)準(zhǔn)操作程序(SOP) 工作、避免在工作過程中形成氣溶膠或濺出、定期進行細胞培養(yǎng)培訓(xùn)，以及實施和遵守GMP的一般準(zhǔn)則。
總結(jié)
細胞培養(yǎng)在生物醫(yī)學(xué)和生物制藥技術(shù)中發(fā)揮著重要作用。然而，物種內(nèi)和物種間交叉污染以及細菌、真菌、或病毒感染可能導(dǎo)致嚴重后果。因此，每個從事細胞培養(yǎng)的環(huán)境都應(yīng)強制定期進行污染檢測和細胞鑒定測試。此外，實施良好的細胞培養(yǎng)規(guī)范和無菌技術(shù)對于提高細胞培養(yǎng)安全性、促進可重復(fù)數(shù)據(jù)的生成以及可比性至關(guān)重要。此外，適當(dāng)?shù)膯T工培訓(xùn)以及細胞培養(yǎng)程序文檔和報告的標(biāo)準(zhǔn)化是促進細胞培養(yǎng)高質(zhì)量工作和安全性的進一步有效手段。最后，操作人員的培訓(xùn)與設(shè)計良好、工程精良的細胞培養(yǎng)設(shè)施建設(shè)同等重要。
多寧生物Media C系列培養(yǎng)基是無動物來源成分，無蛋白成分，化學(xué)限定的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，適合采用CHO細胞進行治療性蛋白產(chǎn)品研發(fā)和生產(chǎn)過程中的分批培養(yǎng)，補料分批培養(yǎng)和灌流培養(yǎng)。適合采用搭配DN feed系列搭配使用。該系列培養(yǎng)基均不含L-谷氨酰胺。推薦的L-谷氨酰胺濃度為 4 mM 至 6 mM。
產(chǎn)品特點：
案例研究：
案例一：Media C-01+DN feed 3/DN feed 4組合
推薦細胞：CHOK1(ATCC)
案例二：Media C-03+DN feed 3/DN feed 4組合
推薦細胞：CHOZN
案例三：Media C-04+DN feed 3/DN feed 4組合
推薦細胞：CHOK1(ECACC)
案例四：Media C-05+DN feed 3/DN feed 4組合
推薦細胞：CHOK1(ATCC)
案例五：Media C-06+DN feed 3/DN feed 4組合
推薦細胞：CHOK1SV
*詳細產(chǎn)品信息，請聯(lián)系marketing@duoningbio.com
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