質(zhì)粒是存在于古生菌、細(xì)菌以及部分酵母中的含有染色體外遺傳信息的小型雙鏈環(huán)狀 DNA 分子，其包含至少一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)，可獨(dú)立自主復(fù)制，一個(gè)細(xì)胞可以包含單個(gè)質(zhì)粒的多個(gè)拷貝。質(zhì)粒骨架序列的遺傳信息可能不是必需的，但至少有助于細(xì)胞在其給定環(huán)境中生存。

在過去的幾十年中，質(zhì)粒DNA（pDNA）成為了遺傳學(xué)和分子生物學(xué)以及最近的基因治療和核酸疫苗中最重要的工具之一。在制藥應(yīng)用中，質(zhì)粒的使用包括直接和間接兩種方式，如質(zhì)粒直接給藥給患者，即患者體內(nèi)將含有DNA本身，對于此類應(yīng)用，如DNA疫苗，完整良好的生產(chǎn)規(guī)范（GMP）是絕對必要的，因?yàn)镈NA本身就是活性藥物成分(API)。另一種方式是間接方式，即pDNA不直接用于患者給藥，而用于生產(chǎn)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的病毒載體或治療性蛋白質(zhì)，或用作模板以生產(chǎn)mRNA，即其不是API，而作為API生產(chǎn)的原材料或起始物料，但即使在這種情況下，質(zhì)粒產(chǎn)品也需按照特定監(jiān)管要求（在質(zhì)量控制和過程記錄方面），符合適用的標(biāo)準(zhǔn)。

科研實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)粒制備常使用市售提取試劑盒，但這種方式不適用于需要數(shù)毫克或數(shù)克規(guī)模的工業(yè)化質(zhì)粒生產(chǎn)，而且更重要的是，實(shí)驗(yàn)室方法制備的質(zhì)粒在純度和安全性等質(zhì)量方面的可重現(xiàn)性較低，而這對于制藥應(yīng)用是一個(gè)先決條件。鑒于pDNA在當(dāng)前先進(jìn)療法開發(fā)中的廣泛應(yīng)用，其已成為下一代生物制藥應(yīng)用中的關(guān)鍵物料，行業(yè)對高質(zhì)量pDNA的需求也在不斷增加，所以，其生產(chǎn)必需實(shí)現(xiàn)更高的效率和生產(chǎn)力。

宿主細(xì)胞的選擇

宿主細(xì)胞的選擇是生物藥生物工藝的決定性因素之一，而質(zhì)粒的產(chǎn)生是菌株/質(zhì)粒依賴性的，因此為特定目的質(zhì)粒選擇合適的菌株至關(guān)重要，合適的宿主菌株的特性包括被質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的能力以及其培養(yǎng)至高生物量的可行性。由于大腸桿菌（E.Coli）有大量可用的生物信息以及在pDNA 生產(chǎn)中的用途，根據(jù)實(shí)驗(yàn)室用途和商業(yè)可用性，已經(jīng)有多種菌株被選擇用于生產(chǎn)pDNA。

此外，由于將pDNA引入E.Coli會導(dǎo)致代謝負(fù)擔(dān)，通常反映為生長速率和生物量的降低，以及乙酸產(chǎn)量的增加。在整體生理水平上了解質(zhì)粒生產(chǎn)的影響機(jī)制是一項(xiàng)不小的挑戰(zhàn)，但這些知識可以為進(jìn)一步的細(xì)胞工程提供有用的信息，如已有研究通過基因敲除或基因過表達(dá)，來減輕宿主生物的代謝負(fù)擔(dān)或指導(dǎo)宿主機(jī)制進(jìn)行pDNA的復(fù)制，從而提高pDNA產(chǎn)量。然而，對宿主細(xì)胞的工程處理也可能導(dǎo)致過度修飾，從而難以控制和預(yù)測宿主中發(fā)生的生理活動?？刂扑拗骷?xì)胞的能力在大規(guī)模生物工藝操作中非常重要。

對于GMP生產(chǎn)，需建立主細(xì)胞庫（MCB）和工作細(xì)胞庫（WCB），以確?？芍貜?fù)的細(xì)菌生物的大規(guī)模培養(yǎng)，細(xì)胞庫需經(jīng)過全面的表征，滿足充分的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，包括宿主一致性、質(zhì)量產(chǎn)量一致性、細(xì)胞庫的純度以及容器的檢測等，并適當(dāng)儲存，以用于后續(xù)生產(chǎn)。

培養(yǎng)工藝和發(fā)酵策略

用于重組蛋白生產(chǎn)的成熟培養(yǎng)技術(shù)也可同樣適用于生產(chǎn)pDNA。然而，由于各種治療用途需要大量的質(zhì)粒，因此需要提高pDNA的生產(chǎn)效率。已有多種方法已被提出用來提高pDNA的生產(chǎn)能力，包括單位體積pDNA產(chǎn)量以及細(xì)菌細(xì)胞特異性生產(chǎn)力。

多個(gè)參數(shù)會影響細(xì)菌生產(chǎn)力，如主細(xì)胞庫選擇、生長速率、培養(yǎng)基、補(bǔ)料速率以及適當(dāng)?shù)纳L條件和參數(shù)，如 pH、滲透壓和溫度。

目前優(yōu)化的E.Coli發(fā)酵通?？蛇_(dá)到40 - 60g/L生物量，pDNA產(chǎn)量可達(dá)到0.5 - 1 g/L，結(jié)合宿主細(xì)胞和載體工程，并進(jìn)一步優(yōu)化發(fā)酵策略，可能可達(dá)到> 2 g/L。

發(fā)酵規(guī)模放大需保持最佳且均質(zhì)的反應(yīng)條件，以最大限度地減少E.Coli應(yīng)激條件暴露并提高代謝準(zhǔn)確性，從而提高產(chǎn)量并確保一致的產(chǎn)物質(zhì)量。需要通過全面且詳細(xì)的工藝表征，鑒定影響產(chǎn)物產(chǎn)量和質(zhì)量的最相關(guān)的過程參數(shù)，并將其作為規(guī)模放大參數(shù)而盡可能保持恒定，從而制定合適的策略。工藝表征可通過在線或近線檢測收集的實(shí)時(shí)或近實(shí)時(shí)數(shù)據(jù)，并結(jié)合支持性方法和工具來進(jìn)行，例如化學(xué)計(jì)量學(xué)數(shù)據(jù)分析和建模，以及通過計(jì)算機(jī)流體動力學(xué)和規(guī)模縮小模型闡明混合和液流條件。為了確保直接且成功的規(guī)模放大，發(fā)酵設(shè)施需嚴(yán)格按照放大標(biāo)準(zhǔn)設(shè)計(jì)，以降低不同培養(yǎng)罐中工藝條件的差異性，同時(shí)充分考慮發(fā)酵參數(shù)之間高度復(fù)雜的相互依賴和相互作用。

細(xì)胞收獲和裂解

離心是最為常見的E.Coli發(fā)酵液收獲方式，在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模條件下，其可實(shí)現(xiàn)簡單、快速的料液處理，對于生產(chǎn)規(guī)模，可選擇大型碟片式離心機(jī)或連續(xù)流離心機(jī)，其挑戰(zhàn)在于較高的固定資產(chǎn)成本投入、較高的能耗以及可能涉及較為繁瑣且需開放式處理的手動操作步驟。切向流過濾技術(shù)是另一種可簡單規(guī)模放大且可實(shí)現(xiàn)連續(xù)封閉式操作的策略，在此過程中，也可將培養(yǎng)基置換至后續(xù)裂解步驟所需的緩沖液體系。

在重組蛋白生產(chǎn)中使用的機(jī)械裂解方法可用于核酸的分離。但是，蛋白質(zhì)工藝中使用的高剪切條件可能會導(dǎo)致核酸降解。所以，這里最常用的細(xì)胞裂解方法是堿裂解，通常使用~pH 12、0.1 - 0.5 N NaOH溶液進(jìn)行，結(jié)合使用0.1-0.2% SDS或Triton X 1-00，通過利用細(xì)胞膜的脆弱性來破壞細(xì)胞，并保持完整的 pDNA。這種方法的規(guī)模放大會有一定的挑戰(zhàn)，因?yàn)檎扯仍黾涌赡軙诨旌线^程中導(dǎo)致對pDNA的剪切。此外，在大規(guī)模條件下可能存在pH梯度，需保證充分但不過于強(qiáng)烈的混合。而裂解過程的時(shí)間也可直接影響pDNA的質(zhì)量和數(shù)量，如時(shí)間過長，可能導(dǎo)致pDNA不可逆地變性。所以，良好設(shè)計(jì)的混合設(shè)備和仔細(xì)控制的裂解參數(shù)是成功的關(guān)鍵。

澄清

細(xì)胞裂解后，將需要除去固體。由于裂解液的粘性，這將是一個(gè)非常關(guān)鍵的步驟?？墒褂秒x心或特定孔徑規(guī)格的深層過濾器去除雜質(zhì)。最近，絮凝被報(bào)導(dǎo)用于過濾操作的預(yù)處理步驟。還有一些策略通過使用高鹽緩沖液和離液劑進(jìn)行沉淀來去除污染物。通常，澄清后的細(xì)菌細(xì)胞堿裂解液中，僅約3%的內(nèi)容物為pDNA，而剩余的97%為其它雜質(zhì)，包括蛋白質(zhì)65%、RNA 25%、內(nèi)毒素4%以及基因組DNA 3%，這種復(fù)雜性也是pDNA下游工藝的挑戰(zhàn)所在，其它挑戰(zhàn)還包括其本身較大的粒徑、高粘度、剪切敏感性以及與雜質(zhì)的相似性。

切向流過濾

切向流過濾是一種可簡單規(guī)模放大且經(jīng)濟(jì)高效的pDNA濃縮以及緩沖液置換技術(shù)，并可通過合適膜MWCO的選擇，部分去除線性DNA、RNA以及內(nèi)毒素等雜質(zhì)，截留pDNA。切向流過濾操作的一個(gè)挑戰(zhàn)是該步驟過程中料液不斷增加的粘度以及pDNA的剪切敏感性。且在某些情況下，由于pDNA的結(jié)構(gòu)特性或由于更高的離子強(qiáng)度所導(dǎo)致的有效粒徑的較低，pDNA可能會穿過比其粒徑更小的膜孔而導(dǎo)致?lián)p失。因此，鑒于3-5X的膜孔選擇經(jīng)驗(yàn)法則，為保證收率，可選擇該范圍的低值。

層析

最終的pDNA必需符合預(yù)先確定的質(zhì)量要求，如無宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)、基因組DNA、RNA以及內(nèi)毒素，且針對特定應(yīng)用，可能要求超螺旋pDNA百分比>90%，所以，pDNA工藝流程中包含層析步驟被認(rèn)為是生產(chǎn)高效且安全的pDNA的基本要求。鑒于雜質(zhì)的復(fù)雜性及其與目標(biāo)pDNA的相似性，可選擇不同模式層析策略的組合^[3]。

陰離子交換層析（AEX）利用帶負(fù)電荷的質(zhì)粒和帶正電荷的固定相之間的靜電相互作用，能夠從開環(huán) pDNA和裂解液的其它成分中選擇性分離超螺旋 pDNA，但電荷和結(jié)構(gòu)與pDNA相似的生物分子，如gDNA、內(nèi)毒素和一些RNA會共純化，且pDNA的結(jié)合載量低。常與AEX組合使用的策略是疏水作用層析（HIC），其利用單鏈核酸雜質(zhì) (RNA、變性gDNA和變性pDNA)和內(nèi)毒素的疏水性，促進(jìn)結(jié)合，并通過疏水性支撐物阻礙這些雜質(zhì)的流動，其可從內(nèi)毒素和單鏈核酸中分離pDNA，但需要在高鹽濃度下進(jìn)行洗脫。親和層析（AC）可在單個(gè)純化步驟中獲得高純度的超螺旋pDNA，并可確保產(chǎn)品在監(jiān)管機(jī)構(gòu)的標(biāo)準(zhǔn)之內(nèi)，其利用基于分子識別的自然生物過程，選擇性純化超螺旋 pDNA，但其使用的生物性配基可能不穩(wěn)定，且通常結(jié)合載量較低。另一種可良好去除RNA和蛋白質(zhì)的方法是尺寸排阻層析（SEC），其利用了pDNA與其它雜質(zhì)之間不同的流體動力學(xué)粒徑，但較難去除gDNA。

除菌過濾

除菌過濾旨在截留細(xì)菌，確保無菌性。pDNA較大的粒徑、純化后的純度以及緩沖液的組成，可能影響過濾器的處理量，導(dǎo)致較低的流速，并降低步驟收率。選擇合適規(guī)格的過濾器前，需綜合考慮這些因素，以實(shí)現(xiàn)除菌級過濾性能的最大化。

儲存

用于制藥應(yīng)用中直接或間接用途的pDNA 產(chǎn)品需要適當(dāng)?shù)膬Υ嫦到y(tǒng)，其需可監(jiān)測和報(bào)告儲存條件，以符合完整的GMP要求。需進(jìn)行特定的評估研究，以確定最佳儲存條件。對于在-20°C 受控條件下儲存的pDNA，分析表明，開環(huán)和超螺旋或共價(jià)閉合環(huán)狀形式的比例保持不變，沒有pDNA的線性化或降解，DNA 的轉(zhuǎn)染顯示表達(dá)性能不變，即該儲存條件有效地保持了 DNA 的完整性^[5]。

一般質(zhì)量要求

鑒于pDNA的不同用途，如在藥物開發(fā)中是用作原材料/關(guān)鍵起始物料、中間體、藥物底物還是藥物產(chǎn)品，監(jiān)管機(jī)構(gòu)和/或pDNA采購方會有不同的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和預(yù)期，但包括DNA濃度、生物負(fù)荷/無菌性、內(nèi)毒素（如<0.1 EU/ug 質(zhì)?；?lt;5 EU/kg體重）、純度 – 殘留宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)(如不可檢測或<0.01μg/劑)、基因組DNA（如<0.05μg/ug 質(zhì)?；?lt;0.01μg/劑）、RNA（如不可檢測） – 和一致性等放行檢測是普遍要求^[6]。