早在針對 SARS-CoV-2 的 mRNA 疫苗將這項技術(shù)推向舞臺中央之前，mRNA 就已被確定為是一種潛在的抗腫瘤疫苗接種方法，而現(xiàn)在，鑒于COVID-19疫苗的巨大成功，mRNA已被探索用于其它各種領(lǐng)域，包括針對其它傳染病的疫苗、抗腫瘤疫苗以及蛋白質(zhì)補(bǔ)充/替代療法等。盡管mRNA對幾乎無處不在的核糖核酸酶敏感并且可能會快速降解，但其同樣具有強(qiáng)大的安全性優(yōu)勢，非復(fù)制意味著它不與基因組相互作用，而其相對不穩(wěn)定性和體內(nèi)快速代謝清除可以通過使用各種修飾來調(diào)節(jié)?，F(xiàn)有的成功經(jīng)驗已經(jīng)證實，將mRNA制劑到不同的載體結(jié)構(gòu)中后，可實現(xiàn)給藥后的快速攝取和高效蛋白質(zhì)表達(dá)。

完整的 mRNA 生產(chǎn)過程面臨多方面的挑戰(zhàn)，包括與起始物料（質(zhì)粒DNA，pDNA）相關(guān)的挑戰(zhàn)，以及mRNA自身的特殊屬性相關(guān)所帶來的挑戰(zhàn)，如其對幾乎無處不在的核糖核酸酶的高度敏感性、對工藝過程產(chǎn)生中的剪切的高度敏感性，以及由于mRNA與某些雜質(zhì)（如雙鏈 RNA 或 dsRNA）的大小相似而導(dǎo)致的分離純化挑戰(zhàn)。在獲得所需目的序列的pDNA模板之后，mRNA的無細(xì)胞下游生產(chǎn)步驟可以概括為：

? 在稱為體外轉(zhuǎn)錄 (IVT) 的酶促反應(yīng)過程中合成mRNA，即將目標(biāo) DNA 序列的模板 – 線性化pDNA、核苷酸 (NTP) 以及酶混合在一起。

? 然后使用層析、切向流過濾和除菌過濾等步驟，從反應(yīng)混合物/污染物中得到純化轉(zhuǎn)錄 mRNA。

? 最后將 mRNA 封裝在一般由4種脂質(zhì)成分組成的脂質(zhì)納米顆粒（LNP）中，最終產(chǎn)品在無菌灌裝之前使用切向流過濾 (TFF) 和/或?qū)游鲞M(jìn)行純化及濃縮。

生產(chǎn) mRNA 的挑戰(zhàn)

mRNA的合成

mRNA 的無細(xì)胞合成需要 pDNA 模板被限制酶線性化，該酶將在超螺旋質(zhì)粒的特定部分進(jìn)行切割。需要去除與此步驟相關(guān)的雜質(zhì)，如使用切向流過濾和/或?qū)游觥Ｈ缓?，將線性化的 DNA 模板在體外轉(zhuǎn)錄（IVT）成 mRNA。將 RNA 聚合酶（如T7 RNA聚合酶）和三磷酸核苷酸添加到線性化且純化的 pDNA 中。為了增加 mRNA 的穩(wěn)定性和/或降低免疫原性，可以使用一些修飾的三磷酸核苷酸。當(dāng)然，這種策略的商業(yè)化應(yīng)用需要考慮到專利保護(hù)的問題。為了穩(wěn)定并允許在細(xì)胞中進(jìn)行有效的 mRNA 轉(zhuǎn)導(dǎo)，需要 3' poly-(A) 尾和 5' 帽。 Poly-(A) 尾對于終止蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄和翻譯至關(guān)重要，它可以防止 3' 核酸外切酶消化 mRNA。 5' 帽通過防止 5' 核酸外切酶降解來穩(wěn)定 mRNA?？梢允褂脙煞N方法來給 mRNA 加帽。加帽可以發(fā)生在轉(zhuǎn)錄步驟中，或者，可以在 IVT 后，使用牛痘病毒加帽酶，以酶促方式實現(xiàn)加帽，后者通常加帽效率更高，但需要先純化 mRNA。

mRNA的純化

在 IVT 之后，轉(zhuǎn)錄的 3’poly-(A)-mRNA-5'帽產(chǎn)物需要從可能存在內(nèi)毒素、免疫原性 dsRNA、殘留 DNA 模板、RNA 聚合酶、截短的 RNA 片段、未使用的三磷酸核苷酸和加帽反應(yīng)過程中產(chǎn)生的其它雜質(zhì)的混合物中純化。有多種選項可用于 mRNA 的純化，通常包括一或兩步的層析步驟，以及基于切向流過濾的超濾/洗濾步驟。

親和層析是常用的高效純化策略，如Poly (dT) 層析，其通過捕獲帶 poly-A 尾的 mRNA，有效去除 DNA、核苷酸、酶、緩沖液成分等不帶 poly-(A) 尾的雜質(zhì)，但不能將 dsRNA 與單鏈RNA (ssRNA) 區(qū)分開來。初始親和層析之后，通常是第二個層析步驟，稱為精純步驟，以進(jìn)一步純化 ssRNA，例如使用陰離子交換層析。有時，也會結(jié)合使用離子交換和疏水作用層析。

使用截留分子量范圍為 30 至 300 kDa 的切向流過濾是將 mRNA 與較小的雜質(zhì)進(jìn)行分離的替代性方式，使用切向流過濾也可在同一單元操作中進(jìn)行濃縮和洗濾換液。

在標(biāo)準(zhǔn)批次模式 IVT 工藝中，在反應(yīng)完成后從反應(yīng)混合物中純化所需的 RNA 產(chǎn)物，而聚合酶、pDNA 模板和未反應(yīng)的三磷酸核苷被丟棄。但由于這些 IVT 反應(yīng)組分價格昂貴，已經(jīng)有開發(fā)人員嘗試使用類似補(bǔ)料分批的轉(zhuǎn)錄策略來進(jìn)行大規(guī)模 mRNA 生產(chǎn)，過程中，監(jiān)測 IVT 反應(yīng)的進(jìn)程，以保持最佳反應(yīng)條件，并在反應(yīng)過程中，將組分按需添加到反應(yīng)器中。獲得完整的全長 RNA 產(chǎn)物的效率，或出現(xiàn)截短的轉(zhuǎn)錄物的幾率，取決于 RNA 序列和反應(yīng)條件的精確控制，需要優(yōu)化，以提高工藝產(chǎn)量。

封裝 mRNA

RNA 對到處存在的核糖核酸酶的快速降解高度敏感，這就需要一個有效的系統(tǒng)，不僅可以穩(wěn)定 mRNA，還可以將 mRNA 引入細(xì)胞。 mRNA 與遞送系統(tǒng)的混合、以及各種脂質(zhì)聚合物成分的選擇組合，已被證明可以保護(hù) mRNA 免受核糖核酸酶降解，增強(qiáng)細(xì)胞攝取，并改善在靶細(xì)胞中的 mRNA 翻譯。

脂質(zhì)納米顆粒 (LNP) 是最常用的 mRNA 遞送系統(tǒng)；其通常由4種不同的脂質(zhì)成分組成，包括可電離陽離子脂質(zhì)、輔助融合磷脂、膽固醇以及聚乙二醇（PEG）-脂質(zhì)。將mRNA 封裝在脂質(zhì)復(fù)合物中，可使其免受核糖核酸酶降解，同時將其有效地遞送到細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中。

LNP 制備的第一個步驟是將脂質(zhì)溶解在溶劑（例如乙醇）中，然后使用錯流或微流體混合器將溶解的脂質(zhì)與含有mRNA 的低 pH 值水性緩沖液快速混合，以獲得包封mRNA的LNP，對混合流道、速度等的優(yōu)化控制是獲得所需粒徑大小、粒徑分布以及包封效率等特性的關(guān)鍵。對產(chǎn)生的 mRNA-LNP 復(fù)合物進(jìn)行洗濾，以用中性緩沖液代替低 pH 緩沖液。此步驟應(yīng)快速進(jìn)行，以避免在低 pH 值下觀察到的脂質(zhì)降解。然后通過超濾方法進(jìn)行濃縮。

LNP 的缺點包括它們可能需要冷鏈物流。此外，鑒于LNP的粒徑，并不總是可以對其進(jìn)行除菌過濾，在這種情況下，必須考慮替代方案，例如采用完全一次性的封閉式工藝。